Часто используется в качестве экспресс-метода для индикации и идентификации вирусов.

Впервые этот метод разработал К. Мюллис (США) в 1983 т. Благодаря высокой чувствительности, специфичности и простоте выполнения его широко применяют в генетике, судебной медицине, диагностике и других областях.

Суть метода - амплификация, т. е. увеличение числа копий строго определенных фрагментов молекулы ДНК in vitro. В этом методе действуют матричный механизм и принцип комплементарности. Две одинарные полинуклеотидные цепи (нуклеиновой кислоты) способны связываться водородными связями в одну двуспиральную, если последовательности нуклеотидов одной точно соответствуют последовательности нуклеотидов другой так, что их азотистые основания могут образовывать пары аденин-тимин и гуанин-цитозин.

ПЦР основана на амплификации ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы, осуществляющей синтез взаимно комплементарных цепей ДНК, начиная с двух праймеров. Праймер - это фрагмент ДНК, состоящий из 20-30 нуклеотидов. Эти праймеры (затравки) комплементарны противоположным цепям ДНК. При синтезе ДНК праймеры встраиваются в цепь новосинтезирующихся молекул ДНК.

Обычно ПЦР ставят в 25-40 циклов. Каждый цикл включает три этапа: первый - денатурация при 92-95 °С. При этом две цепи ДНК расходятся; второй - отжиг, или присоединение праймеров при 50-65 °С; третий - элонгация, или полимеризация при 68-72 °С, при этом ДНК-полимераза осуществляет комплементарное достраивание цепей ДНК-матрицы с помощью четырех видов нуклеотидов. В результате одного цикла происходит удвоение искомого генетического материала. Образовавшиеся в первом цикле цепи ДНК служат матрицами для второго цикла и т. д. После первого цикла амплифицируется только фрагмент между двумя праймерами. Таким образом, идет удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 25-40 циклов насинтезировать миллионы (2 n) фрагментов ДНК - количество, достаточное для индикации их различными методами (методом гибридизационных зондов, содержащих определенную метку, электрофорезом и т. д.). Чаще для этой цели используют метод электрофореза в агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием.

В ПЦР из участков ДНК возбудителя используют праймеры, которые имеют уникальную последовательность нуклеотидов, характерных только для определенного возбудителя.

Методика постановки ПЦР сводится к следующему: из исследуемого материала выделяют ДНК-матрицу; в пробирке соединяют выделенную ДНК с амплификационной смесью, в которую входят ДНК-полимераза, все 4 вида нуклеотидов, 2 вида праймеров, MgCl, буфер, деионизированная вода и минеральное масло. Затем пробирки помещают в амплификатор, и проводят амплификацию в автоматическом режиме по заданной программе, соответствующей виду возбудителя. Результаты регистрируют чаще методом электрофореза в 1-2%-ном агарозном геле в присутствии бромистого этидия, который соединяется с фрагментами ДНК и выявляется в виде светящихся полос при облучении геля УФ-лучами на трансиллюминаторе. Все процедуры ПЦР занимают 1-2 рабочих дня.

С целью повышения специфичности и чувствительности ПЦР применяют различные варианты: гнездовую ПЦР; ПЦР с «горячим стартом» с использованием парафиновой прослойки или блокады активных центров полимеразы моноклональными антителами. Кроме того, некоторые фирмы выпускают лиофилизированные наборы реагентов для проведения амплификации ДНК, которые позволяют ускорить процесс проведения ПЦР и уменьшить возможность появления ложноположительных результатов.

В настоящее время внедряется новая технология ПЦР-ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR). Ее принципиальная особенность - мониторинг и количественный анализ накопления продуктов полимеразной цепной реакции и автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов. Этот метод не требует стадии электрофореза, что позволяет снизить предъявляемые к ПЦР требования лаборатории. ПЦР в реальном времени используют флуоресцентно-меченые олигонуклеотидные зонды для детекции ДНК в процессе ее амплификации. ПЦР в реальном времени позволяет провести полный анализ пробы в течение 20-60 мин и теоретически способа детективировать даже одну молекулу ДНК или РНК в пробе.

Система детекции продукта в полимеразной цепной реакции «real-time» (мониторинговая ПЦР) позволяет цикл за циклом следить за накоплением амплифицированной ДНК. Система включает и себя олигонуклеотидный зонд, который способен присоединяться (гибридизироваться) к внутреннему сегменту ДНК-мишени. На 5′-конце зонд помечен флуоресцентным красителем-репортером (reporter dye), а на 3′-конце - блокатором (quencher dye). По мере накопления продукта ПЦР зонд гибридизируется к нему, однако свечения не происходит из-за близости между репортером и блокатором. В результате копирования последовательности полимераза достигает 5′-конца зонда. 5’-3′-экзонуклеазная активность полимеразы отсоединяет флуоресцентную метку с 3′-конца пробы, тем самым освобождая флуоресцирующий репортер от его связи с блокатором сигнала, что и приводит к увеличению флуоресценции. Уровень флуоресценции, таким образом, пропорционален количеству специфичного продукта реакции. Важно, что результаты ПЦР регистрируются по наличию флуоресценции в закрытых пробирках и, таким образом, решается еще одна из основных проблем этого метода - проблема контаминации ампликонами.

Достоинства ПЦР: быстрота анализа; высокие чувствительность и специфичность; минимальное количество исследуемого материала; простота в исполнении и возможность полной автоматизации.

Ввиду того что чувствительность ПЦР может достигать до детекции одной копии ДНК-матрицы, существует высокая степень опасности получения ложноположительных результатов. Поэтому генно-диагностической лабораторией при постановке ПЦР необходимо неуклонно выполнять специальные требования к планировке и режиму работы.

ПЦР является одним из дополняющих методов, существующих в вирусологической диагностике. Эта реакция очень важна для диагностики вирусных инфекций, когда вирусные антигены или вирусспецифические антитела не могут быть обнаружены и когда присутствие вирусной нуклеиновой кислоты может быть единственным свидетельством заражения, особенно при латентно протекающих и смешанных инфекциях.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter .

Для того чтобы быстро и с высокой точностью выявить у человека наличие генетических и иных заболеваний сегодня врачами используется ПЦР диагностика. Этот анализ обладает высокой информативностью и широко применяется специалистами разной направленности. Это исследование способно показать наличие болезни задолго до появления симптоматики. Сегодня без этого анализа врачи не ставят окончательного диагноза.

Суть метода

Метод был открыт еще в 1983 году американским ученым по имени Кэри Мюллис. Позже за свое изобретение ученый был удостоен премии Нобеля. Что же такое тест ПЦР? Принцип метода заключается в том, что в условиях лаборатории специалисты многократно увеличивают количество фрагментов ДНК человека. При этом увеличивается и молекула инфекции. Таким образом, чужеродные клетки становятся видимы в микроскоп.

Сегодня метод ПЦР используется в разных областях. Именно он помогает идентифицировать биологический материал криминалистам, установить спорное отцовство или материнство, помогает выявить генетические заболевания, указывает на наличие или отсутствие инфекционных болезней.

Что может обнаружить анализ

ПЦР методику в наши дни активно применяют для обнаружения скрытых инфекций. Благодаря особой технологии анализа инфекцию можно обнаружить на самых ранних стадиях, когда о симптомах еще не может идти и речи.

Исследование методом ПЦР может показать наличие следующих заболеваний:

• Онкологические болезни.
• Гепатиты всех видов и подвидов.
• Уреаплазмоз.
• Сальмонеллез.
• Кандидоз.
• Дифтерия.
• Хламидиоз.
• Цитомегаловирус.
• Микоплазмоз.
• Хеликобактериоз.
• Герпес.
• Гонорея и др.

Особое значение ПЦР диагностика инфекций имеет для выявления хронических вялотекущих и скрытых инфекций, которые не проявляют себя специфичной симптоматикой. Такое исследование часто назначают при планировании беременности. Важно исследовать кровь не только будущей матери, но и отца, ведь многие заболевания могут передаваться по наследству.

Преимущества анализа

Анализ методом ПЦР обладает рядом бесспорных преимуществ перед другими видами исследования крови на наличие инфекций, а именно:

• Выявление возбудителя болезни с высокой точностью.
• Исключение ложноположительных результатов.
• Возможность обнаружения даже одной клети возбудителя.
• Возможность исследовать биологический материал для выявления нескольких инфекций одновременно.
• Быстрое получение результатов исследования.
• Возможность обнаружения инфекции до клинических проявлений болезни.

Сегодня метод постоянно совершенствуется. Появляются новые тесты на обнаружение опасных вирусов и инфекций. По данным статистики именно это обследование позволяет обнаружить вредоносные клетки задолго до появления клинических симптомов. Это значит, что анализ относится к методам ранней диагностики, что позволяет провести лечение пациента на самых ранних стадиях болезни.

Особое значение сегодня врачи придают этому методу в обнаружении раковых клеток в организме.

Современные врачи заявляют, что использование полимеразной цепной реакции ПЦР в борьбе с раком является самым современным и эффективным методом диагностики онкологии на ранних стадиях заболевания.

Разновидности анализа

Сегодня врачи часто предлагают сделать комплексный тест ПЦР. Данное исследование более информативно и помогает врачам быстро поставить точный диагноз. Анализ на отдельный возбудитель чаще всего проводится для контроля лечения или при подозрении на то или иное заболевание, а комплексный тест помогает выявить скрытые инфекции.

Самыми частыми комплексными исследованиями являются ПЦР 6 и ПЦР 12. Цифры в названии означают количество инфекций, на которые исследуется биологический материал. Также бывает ПЦР количественный или качественный. Первый чаще всего дороже, ведь он с точностью определяет количество вирусных клеток в биологическом материале, а значит, помогает установить стадию заболевания.

Чаще всего анализ назначается в том случае, когда врачи не могут выявить возбудителя болезни. Так, к примеру, у пациента есть определенные симптомы заболевания, а другие исследования не выявляют инфекцию. В этом случае метод ПЦР просто незаменим. Также исследование обязательно перед планированием беременности. Помимо этого анализ крови назначается на выявление врожденных генетических заболеваний и по другим показаниям врача. Помимо этого исследование может быть назначено по решению суда для определения отцовства или иных показателей по запросу прокуратуры.

Материал для исследования

Материалом для исследования методом ПЦР диагностики могут служить различные жидкости и среды человека. Чаще всего для исследования берут кровь, мочу, соскобы и слизь пациента. Забор того или иного материала напрямую зависит от исследования на те или иные инфекции.

Половые болезни определяются по мазкам, взятым из половых органов, моче или соскобу. Для определения наличия ВИЧ, гепатитов, токсоплазмоза и других инфекций врачам нужно исследовать кровь пациента. Иногда на анализ берут спинномозговую жидкость, к примеру, чтобы обследовать ее на наличие инфекций нервной системы. А для обнаружения внутриутробных инфекций необходимо сдать пробы околоплодных вод и тканей плаценты.

Сегодня гинекологи советуют сдать тест ПЦР всем женщинам в самом начале беременности, если вы не сделали анализ на этапе ее планирования.

Этот тест нужно сдавать до 12 недель беременности. Материал для исследования берется из шейки матки. Процедура безопасна и не доставляет дискомфорта. Анализ позволяет выявлять опасные инфекции, которые могут повлиять на внутриутробное развитие плода. Данный анализ называется ПЦР-6.

Правила сдачи и расшифровка

Каждый пациент должен знать, что точность результата любого анализа зависит от соблюдений правила сдачи биоматериала. Способ и правила сдачи анализа определяются видом теста. Если вам нужно сдать кровь, на забор нужно приходить утром на голодный желудок. Если необходимо исследование на половые инфекции, следует соблюдать половой покой минимум сутки до забора материала. Забор мочи также требует соблюдение определенных правил. Мочу нужно собирать во время первого утреннего мочеиспускания. Собрать надо среднюю мочу, перед этим нужно помыться и вытереться чистым полотенцем. Посуда должна быть стерильной.

Расшифровка результата исследования не представляет особой сложности. В молекулярной ДНК РНК диагностике методом ПЦР результат может быть только положительным или отрицательным. На бланке лаборатории напротив каждой инфекции, на которые было проведено исследование можно увидеть знак «+» или «-». Соответственно «+» это положительный результат, который говорит о том, что в исследуемом материале найдены следы данной инфекции.

При расшифровке анализа очень важно определить количественное соотношение клеток вируса. Не всегда наличие инфекции можно расценивать как заболевание. Есть такое понятие как носительство инфекции. Это значит, что у человека есть клетки инфекции, но он этой болезнью не болеет. Однако такое носительство не уберегает от возможности заражения других людей. Именно количественный анализ помогает врачам определить, являетесь вы носителем или больным, а также идентифицировать стадию заболевания и подобрать эффективную терапию.

Где сдать

Многие пациенты интересуются, где сдать ПЦР, чтобы получить достоверный результат? Сегодня сдать анализ можно в любой специализированной клинике или частном медицинском центре. Анализ ПЦР платный, его цена зависит от вида исследования.

В районных поликлиниках данного исследования не проводят, там просто нет специального современного оборудования.

Многие люди пренебрегают анализом, считая, что данное исследование им не нужно. Однако если врач назначил вам данный анализ, значит, у него возникли определенные трудности с постановкой точного диагноза, а значит и с назначением эффективной терапии. В этом случае исследование лучше пройти, ведь это в ваших интересах.

Также все молодые пары, которые планируют беременность, должны пройти данное обследование. Направление на анализ можно получить в центре планирования семьи. Многие пары также не придают анализу должного значения, считая, что если у супругов нет явных наследственных заболеваний, то и малыш у них родится здоровым. Однако сегодня существует масса скрытых инфекций, которые могут повлиять на течение беременности и здоровье малыша.

Сегодня диагностические методы могут выявить самые скрытые инфекции, которые годами могут жить в организме человека, никак себя не проявляя. Однако не нужно самостоятельно сдавать анализы. Все исследования должны проводиться по показаниям лечащего врача, иначе ваша жизнь может превратиться в бесконечные походы по диагностическим центрам. В первую очередь при любых жалобах нужно идти к врачу. Именно он сможет провести оценку вашего состояния и назначить только нужные именно для вас анализы.

Вконтакте

ГОУ ВПО «Красноярская государственная медицинская академия

имени -Ясенецкого Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию »

Кафедра медицинской генетики и клинической нейрофизиологии ИПО

ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ МЕТОДА

ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

Методическое пособие для студентов 3-4 курсов

по специальностям лечебное дело (060101) и

Красноярск - 2007

Шнайдер, Н. А., Бутьянов, Р. А. Основные принципы метода полимеразной цепной реакции. Методическое пособие для внеаудиторной работы студентов 3-4 курсов по специальностям лечебное дело (060101) и педиатрия (060103). – Красноярск: Изд-во ГОУ ВПО КрасГМА, 2007. – 42с.

Методическое пособие полностью соответствует требованиям Государственного стандарта (2000) и отражает основные аспекты современного метода диагностики наследственных заболеваний человека – метода полимеразной цепной реакции, учебный материал адаптирован к образовательным технологиям с учетом специфики обучения на 3-4 курсах лечебного и педиатрического факультетов.

Рецензенты: заведующая кафедрой медицинской генетики ГОУ ВПО

«Новосибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», д. м.н., профессор;

Репликация ДНК

Объектом исследования данного метода является Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК). ДНК является универсальным носителем генетической инфор­мации у всех существующих на Земле организмов (исключение - РНК-содержащие микроорганиз­мы). ДНК представляет собой двойную нить, скрученную в спираль. Каждая нить состоит из соеди­ненных последовательно нуклеотидов. Нити ДНК имеют противоположную направленность: 5"-концу одной нити соответствует 3"-конец второй нити. Уникальным свойством ДНК является ее способность удваиваться. Данный процесс называется репликацией . Репликация молекулы ДНК происходит в синтетический период интерфазы. Каждая из двух цепей «материнской» молекулы служит матрицей для «дочерней». После репликации вновь синтезированная молекула ДНК содержит одну «материнскую» цепочку, а вторую - «дочернюю», вновь синтезированную (полуконсервативный способ). Для матричного синтеза новой молекулы ДНК необходимо, чтобы старая молекула была деспирализована и вытянута. Репликация начинается в нескольких местах молекулы ДНК. Участок молекулы ДНК от точки начала одной репликации до точки начала другой называется репликоном .

Начало репликации активируется праймерами (затравками), состоящими из 100-200 пар нуклеотидов. Фермент ДНК-хеликаза раскручивает и разделяет материнскую спираль ДНК на две нити, на которых по принципу комплементарности при участии фермента ДНК-полимеразы собираются «дочерние» цепи ДНК. Для того чтобы фермент начал свою работу, требуется наличие стартового блока - небольшого начального двухцепочечного фрагмента. Стартовый блок образуется при взаимодействии праймера, с комплиментарным участком соответствующей цепи родительской ДНК. В каждом репликоне ДНК-полимераза может двигаться вдоль «материнской» нити только в одном направлении (5`=>3`).

На лидирующей нити по мере раскручивания репликона постепенно непрерывно наращивается «дочерняя» цепь. На отстающей нити дочерняя цепь синтезирует также в направлении (5`=>3`), но отдельными фрагментами по мере раскручивания репликона.

Таким образом, присоединение комплементарных нуклеотидов «дочерних» нитей идет в противоположных направлениях (антипараллельно). Репликация во всех репликонах идет одновременно. Фрагменты и части «дочерних» нитей, синтезированные в разных репликонах, сшиваются в единую нить ферментом лигазой. Репликация характеризуется полуконсервативностью, антипараллельностью и прерывистостью. Весь генном клетки реплицируется один раз за период времени, соответствующий одному митотическому циклу. В результате процесса репликации из одной молекулы ДНК образуется две молекулы ДНК, в которых одна нить от материнской молекулы ДНК, а вторая, дочерняя, вновь синтезированная (рис. 1).

Рис. 1. Схема репликации молекулы ДНК.

Таким образом, цикл репликации ДНК включает в себя три основные стадии:

1. расплетение спирали ДНК и расхождение нитей (денатурация);

2. присоединение праймеров;

3. достраивание цепи дочерней нити.

Принцип метода ПЦР

Именно репликация ДНК легла в основе ПЦР. В ПЦР перечисленные выше процессы осуществляются в пробирке в циклическом режиме. Переход от одной стадии реакции к другой достигается изменением температуры инкубационной смеси. При нагревании рас­твора до 93-95°С происходит денатурация ДНК. Для перехода к следующему этапу - присоедине­нию или "отжигу" праймеров - инкубационную смесь охлаждают до 50-65°С. Далее смесь нагревают до 70-72°С - оптимум работы taq-ДНК-полимеразы - на этой стадии происходит достраивание новой нити ДНК. Далее цикл повторяется снова. Другими словами метод ПЦР представляет собой многократное увеличение числа копий (амплификация ) специфического участка ДНК катализируемое ферментом ДНК - полимеразой.

Наращивание дочерних нитей ДНК должно идти одновременно на обеих цепях материнской ДНК, поэтому для репликации второй цепи также требуется свой праймер. Таким образом, в реакционную смесь вносятся два праймера: один для "+"-цепи, второй для "-"-цепи. Присоединившись к противоположным цепям молекулы ДНК, праймеры ограничивают собой тот ее участок, который будет в дальнейшем многократно удвоен или амплифицирован. Длина такого фрагмента, который называется ампликоном, обычно составляет несколько сот нуклеотидов.

Этапы ПЦР

Каждый цикл амплификации включает 3 этапа, протекающие при различных температурных режимах (рис. 2).

· 1 этап: денатурация ДНК. Протекает при 93-95° в течение 30-40 сек.

· 2 этап: отжиг праймеров. Присоединение праймеров происходит комплиментарно к соответст­вующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического уча­стка. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой распола­гаются в интервале 50-65°С. Время отжига 20-60 сек.

· 3 этап: достраивание цепей ДНК.Комплиментарное достраивание цепей ДНК происходит от 5"-конца к 3"-концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения прай­меров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор дезоксирибонуклеозидтрифосфаты. Процесс синтеза катализируется ферментом taq-полимеразой и проходит при температуре 70-72°С. Время протекания синтеза - 20-40 сек.

Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для второго цикла амплификации, в котором происходит образование специфического фрагмента ДНК–ампликона (рис. 3). В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей.

Таким образом, происходит накопление ампликонов в растворе по формуле 2", где п - число циклов амплификации. Поэтому, даже если в исходном растворе первоначально находилась только одна двухцепочечная молекула ДНК, то за 30-40 циклов в растворе накапливается около 108 молекул ампликона. Этого количества достаточно для достоверной визуальной детекции этого фрагмента ме­тодом электрофореза в агарозном геле.

Процесс амплификации проводится в специальном программируемом термостате (амплификаторе ), который по заданной программе автоматчески осуществляет смену температур согласно числу циклов амплификации.

Для проведения амплификации необходимы следующие компоненты:

· ДНК-матрица (ДНК или ее часть, содержащая искомый специфический фрагмент);

· Праймеры (синтетические олигонуклеотиды (20-30 нуклеотидных пар), комплементарные последовательностям ДНК на границах определяемого специфического фрагмента). Выбор специфического фрагмента и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации, что сказывается на качестве проведения анализа.

· Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) (смесь четырех дНТФ, являющихся материалом для синтеза новых комплементарных цепей ДНК в эквивалентных концентрациях 200-500 мкм)

· Фермент Taq -полимераза (термостабильная ДНК-полимераза, катализирующая удлинение цепей праймеров путем последовательного присоединения нуклеотидных оснований к растущей цепи синтезируемой ДНК, 2-3 мМ).

· Буферный раствор (реакционная среда, содержащая ионы Mg2+, необходимые для поддержания активности фермента, PH 6,8-7,8).

Для определения специфических участков генома РНК-содержащих вирусов , сначало получают ДНК-копию с РНК-матрицы, используя реакцию обратной транскрипции (RT), катализируемую ферментом ревертазой (обратной транскриптазой).

Рис. 2. Амплификация (1-ый цикл).

Рис. 3. Амплификация (2-ой цикл).

Основные области применения ПЦР

· клиническая медицина:

o диагностика инфекций,

o выявление мутаций, в том числе диагностика наследственных заболеваний,

o генотипирование, в том числе HLA-генотипирование,

o клеточные технологии

· экология (как способ мониторинга состояния и качества объектов окружающей среды и продуктов питания)

· определение трансгенных организмов (ГМО)

· идентификация личности, установление отцовства, криминалистика

· общая и частная биология,

Основные принципы

организации диагностических лабораторий

Работы в ПЦР-лаборатории проводятся согласно "Правилам устройства, техники безопасности , производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в ла­бораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждениях системы здравоохранения.

Контаминация образцов ДНК

Проведение ПЦР-диагностики связано с проблемой, обусловленной высокой чувствительностью метода, - возможностью контаминации. Попадание в реакционную пробирку следовых количеств положительной ДНК (специфических продуктов амплификации ДНК - ампликонов; ДНК-стандарта, используемого в качестве положительного контроля; положительной ДНК клинического образца) приводит к амплификации в процессе ПЦР специфического фрагмента ДНК и, как следствие, к появлению ложноположительных результатов.

В процессе работы могут встретиться два вида контаминации :

1. перекрестная контаминация от пробы к пробе (в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси), приводящая к появлению спорадических ложноположи­тельных результатов;

2. контаминация продуктами амплификации (ампликонами), имеющая наибольшее значение, т. к. в процессе ПЦР ампликоны накапливаются в огромных количествах и являются идеальными продук­тами для реамплификации.

Контаминация следовыми количествами ампликонов посуды, автоматических пипеток и лабора­торного оборудования, поверхности лабораторных столов или даже поверхности кожи сотрудников лаборатории приводит к появлению систематических ложноположительных результатов. Определить источник контаминации бывает очень трудно и требует значительных за­трат времени и средств. Накопленный к настоящему времени опыт работы лабораторий, исполь­зующих метод ПЦР для диагностики позволяет сформулировать основные требования к организа­ции таких лабораторий и проведению самих анализов. Соблюдение данных требований позволяет исключить возможность контаминации и получения ложноположительных результатов.

Стадии проведения ПЦР анализа

Территориально разделяют, размещая их в отдельных помещениях (рис.4,5):

· Пре-ПЦР-помещение, где производится обработка клинических образцов, выделение ДНК, приготовление реакционной смеси для ПЦР и постановка ПЦР (при наличии условий два последних этапа рекомендуется также проводить в дополнительном отдельном помещении). В этих помещениях запрещается проводить все другие виды работ с исследуемыми агентами, ПЦР-диагностика которых проводится в данной лаборатории.

· Пост-ПЦР-помещение, где проводится детекция продуктов амплификации. В этом помещении допускается использовать другие методы детекции. Желательно комнату детекции продуктов амплификации расположить как можно дальше от пре-ПЦР-помещений.

Рабочие помещения оснащены ультрафиолетовыми лампами с максимумом излучения в области 260 нм (типа ДБ-60) из расчета 2,5 Вт на 1 м3. Лампы расположены так, чтобы прямому облучению подвергались поверхности рабочих столов, оборудование и материалы, с которыми имеет контакт оператор во время проведения ПЦР-анализа. Облучение проводится в течение 1 часа до начала работы и в течение 1 часа после окончания работы.

Врачи-лаборанты работают в специальной лабораторной одежде, сменяемой при переходе из одного помещения в другое, и в одноразовых перчатках. Обработка одежды из разных помещений произво­дится отдельно. На разных этапах проведения ПЦР-анализа работают различные сотрудники.

Для работы используют отдельные наборы дозаторов, пластиковой и стеклянной посуды, лабораторного оборудования , халатов и перчаток предназначенные для различных стадий анализа и не переносимые из одного помещения в другое. Оборудование, материалы и инвентарь в каждой комнате имеют соответствующую маркировку.

Все этапы работы проводят только с использованием одноразовых расходуемых материалов: наконечников для автоматических пипеток, пробирок, перчаток и т. д. Обязательно меняют наконечни­ки при переходе от пробы к пробе. Необходимо использовать наконечники с фильтром - аэрозоль­ным барьером для предотвращения попадания микрокапель раствора в пипетку. Использованные пробирки и наконечники сбрасываются в специальные контейнеры или емкости, содержа­щие дезинфицирующий раствор. Клинические образцы хранят отдельно от реагентов.

Для обработки и уборки рабочего места в каждом помещении имеется ватно-марлевые тампоны (салфетки), пинцет, дезинфицирующий и инактивирующий растворы.

В ПЦР-диагностической лаборатории исключается проведение работ, связанных с получени­ем (клонированием) и выделением рекомбинантных плазмид, содержащих последовательности ДНК или фрагментов генов возбудителей, которые диагностируются в данной лаборатории.

Забор клинического материала

Исследуемым материалом для ПЦР могут служить соскобы эпителиальных клеток, кровь, плазма, сыворотка, плевральная и спинномозговая жидкости, моча, мокрота, слизь и другие биологические выделения, биоптаты.

Забор материала производится в условиях процедурного кабинета соответствующего профиля. После забора пробы как можно скорее должны быть доставлены в ПЦР-диагностическую лабораторию.

Забор образцов необходимо производить при помощи стерильного, желательно одноразового, инструментария только в одноразовые стерильные пластиковые пробирки или в стеклянные пробирки, предварительно обработанные в течение часа хромовой смесью, тщательно промытые дистиллированной водой и прокаленные в сушильном шкафу при температуре 150°С в течение 1 часа.

Зона детекции (другой этаж или другое здание).

Рис. 4. Устройство ПЦР-лаборатории с детекцией электрофорезом.

Зона детекции (другой этаж или другое здание)

Рис. 5. Устройство ПЦР-лаборатории с флуоресцентной детекцией (количественный анализ).

Рис. 6. Комната выделения ДНК. Показан настольный бокс с бактерицидной лампой.

Рис. 7. Комната амплификации.

Рис. 8. Комната детекции.

Рис. 9. Образцы крови для ДНК-диагностик наследственных заболеваний .

Хранение и транспортировка образцов

Для диагностики наследственных заболеваний образцы крови хранятся на специальных бумажных бланках или в эпиндорфах (пластиковых пробирках) в замороженном состоянии в течение длительного времени (рис. 9).

Для диагностики инфекционных заболеваний образцы находятся при комнатной температуре не более 2-х часов. При необходимости более длительного хранения пробы могут быть помещены в холодильник с температурой 2-8°С на срок не более суток. Более продолжительное хранение (до 2-х недель) допустимо в замороженном виде в морозильной камере при температуре минус 20°С. Не допускается повторное замораживание-оттаивание проб.

Если ПЦР-диагностическая лаборатория и процедурный кабинет для забора проб территориально разобщены, то транспортировка проб должна осуществляться в термосах или термоконтейнерах с соблюдением правил хранения образцов и правил транспортировки инфекционных материалов.

Выделение ДНК из образцов

Широкую распространенность получил метод твердофазной сорбции, заключающийся в добавлении лизирующего агента, содержащего раствор гуанидина, сорбции ДНК на сорбенте, многократной отмывки и ресорбции ДНК буферным раствором. В случае обработки сыворотки, плазмы или цельной крови обычно используется метод фенольной экстракции. Метод включает депротеинизацию фенолом/хлороформом с последующим осаждением ДНК (или РНК) этанолом или изопропанолом. Обработка произво­дится в микроцентрифужных пробирках типа «Eppendor P» объемом 1,5 мл. Время обработки составляет 1,5-2 часа (рис.10).

Рис. 10. Выделение ДНК.

Проведение ПЦР

Определенное количество образца из обработанной клинической пробы переносится в специальную микроцентрифужную пробирку типа «Eppendorf"» объемом 0,2 или 0,5 мл. В эту же пробирку добавляется амплификационная смесь, состоящая из воды, ПЦР-буфера, раствора дНТФ, раствора праймеров и раствора Taq-полимеразы (добавляется в смесь в последнюю очередь). Как правило, объем реакционной смеси составляет 25 мкл. Затем в каждую пробирку добавляется одна капля минерального масла для предотвращения испарения реакционной смеси в процессе амплификации. Пробирки переносятся в программируемый термостат (амплификатор), где проводится амплификация в автоматическом режиме по заданной программе (рис. 11).

Рис. 11. Амплификатор « Thermocycler ».

Время проведения реакции в зависимости от заданной программы составляет 2-3 часа. Параллельно с опытными пробами ставятся контрольные: положительный контроль включает в себя все компоненты реакции, но вместо материала клинического образца вносится контрольный препарат ДНК исследуемого гена. Отрицательный контроль включает в себя все компоненты реакции, но вместо клинического материала или препарата ДНК вносится соответствующее количество деионизованной воды или экстракта, не содержащего исследуемой ДНК. Отрицательный контроль необходим для проверки компонентов реакции на отсутствие в них ДНК вследствие контаминации и исключить учет ложноположительных результатов.

Регистрация результатов

Амплифицированный специфический фрагмент ДНК выявляют методом электрофореза в агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Бромистый этидий образует с фрагментами ДНК устойчи­вое соединение внедрения, проявляющееся в виде светящихся полос при облучении геля УФ-излучением с длиной волны 290-330 нм. В зависимости от размера образующихся в результате ПЦР ампликонов используют гель с содержанием агарозы от 1,5% до 2,5%. Для приготовления агарозного геля расплавляют в СВЧ-печи или на водяной бане смесь агарозы, буфера и воды, добавляют раствор бромистого этидия. Охлажденную до 50-60°С смесь заливают в форму слоем толщиной 4-6 мм и с помощью специальных гребенок делают в геле карманы для нанесения образца. Гребенки устанавливают таким образом, чтобы между дном лунок и основанием геля оставался слой агарозы 0,5-1 мм. После застывания геля в карманы наносится амплификат в количестве 5-15 мкл. Рекомен­дуется параллельно с контрольными и опытными пробами проводить электрофорез смеси маркеров длин фрагментов ДНК. Обычно такая смесь содержит десять фрагментов ДНК длинной 100, 200, 300 и т. д. пар оснований.

Постановка такой пробы позволяет верифицировать длину ампликонов в контрольных и опытных пробах. Гель с нанесенным образцом переносят в камеру для электрофореза, заполненную буфером, камеру подключают к источнику питания и проводят электрофоретическое разделение продуктов амплификации в течение 30-45 мин при напряженности электрического поля 10-15 В/см. При этом фронт красителя, входящего в состав реакционной смеси должен пройти не менее 3 см.

После окончания электрофореза гель переносят на стекло трансиллюминатора и просматривают в ультрафиолетовом свете. Для документирования гель фотографируют на пленку типа "Микрат 300" или регистрируют с помощью видеосистемы, соединенной с компьютером.

В первую очередь оценивают контрольные пробы. В электрофоретической дорожке, соответствующей положительному контролю, должна присутствовать оранжевая светящаяся полоса. Ее электрофоретическая подвижность должна соответствовать указанной в инструкции длине ампликона.

В электрофоретической дорожке, соответствующей отрицательному контролю, такая полоса должна отсутствовать. Наличие такой полосы в отрицательном контроле свидетельствует о контаминации - загрязнении используемых реагентов исследуемой ДНК или ампликоном. Опытные пробы оценивают по наличию в соответствующей дорожке полосы, которая располагается на том же уровне, что и полоса в положительной контрольной пробе. Интенсивность свечения полосы соответствует количеству исследуемой ДНК в пробе, что позволяет проводить полуколичественную оценку ПЦР. Обычно положительные результаты оценивают по четырехбальной шкале. Если же свечение полосы в опытной пробе очень слабое, то такую пробу следует переставить (рис. 12).

Рис. 12. Электрофорез в агарозном геле.

Применения ПЦР для диагностики точковых мутаций и полиморфизмов генов

Одним из ведущих направлений применения ПЦР в практическом здравоохранении является диагностика точковых мутаций и полиморфизмов генов. Выделяют прямые и косвенные методы ДНК-диагностики. В тех ситуациях, когда известен ген, повреждение которого приводит к развитию наследственного заболевания, можно это повреждение обнаружить молекулярно – генетическими методами. Такие методы называются прямыми. С помощью прямых методов выявляются нарушения в первичной нуклеотидной последовательности ДНК (мутации и их типы). Прямые методы отличаются точностью, достигающей почти 100%.

Однако на практике указанные методы могут применяться при определенных условиях :

· при известной цитогенетической локализации гена, ответственного за развитие наследственного заболевания;

· должен быть клонирован ген заболевания и известна его нуклеотидная последовательность.

Целью прямой ДНК-диагностики является идентификация мутантных аллелей.

Таким образом, в тех ситуациях, когда известно, какое именно повреждение ДНК приводит к наследственному заболеванию, исследуется непосредственно фрагмент ДНК, содержащий повреждение, т. е. используется прямой метод ДНК-диагностики.

Однако к настоящему времени гены многих заболеваний не картированы, неизвестна их экзонно-интронная организация и многие наследственные болезни отличаются выраженной генетической гетерогенностью, что не позволяет в полной мере использовать прямые методы ДНК-диагностики. Поэтому в тех случаях, когда локализация повреждения не известна, используется другой подход, связанный с изучением окрестности гена, ответственного за генное заболевание, в сочетании с семейным анализом, то есть используются косвенные методы молекулярно-генетической диагностики наследственных болезней.

Для выявления точковых мутаций и небольших делеций могут использоваться различные способы, однако все они основаны на использовании метода ПЦР. Данная реакция позволяет многократно умножить нуклеотидную последовательность ДНК, а затем осуществить поиск мутаций. Методы поиска фрагментов ДНК, несущих мутации, основаны на сравнительном анализе мутантных и нормальных нуклеотидных последовательностей ДНК.

Анализ продуктов ПЦР

в процессе прямой ДНК-диагностики

Предполагает исследование конкретных особенностей амплифицорованного участка гена. Так, при заболеваниях, обусловленных экспансией тринуклеотидных повторов, продукты амплификации различаются по своей длине (отражающей различное число триплетов в изучаемом участке гена) и, как следствие – по их скорости движения в геле. Благодаря этому достигается четкое электрофоретическое разделение нормальных и мутантных аллелей и точное определение патологически удлиненного фрагмента, т. е. ДНК-диагностика болезни (рис. 13).

https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width="417" height="110 src=">

Рис. 14. Диагностика делеции GAG в гене DYT 1 у больных дофа-независимой дистонией (электрофорез в полиакриламидном геле). Дорожки 2,3,6 – больные; дорожки 1,4,5 – контроль. Тонкой стрелкой обозначен нормальный аллель, жирной стрелкой – мутантный более короткий аллель (делеция трех нуклеотидов).

Если исследуемый участок ДНК целиком входит в состав протяженной делеции, то ПЦР-амплификация ДНК с данного делетированного аллеля осуществляеться не будет в связи с отсутствием мест для гибридизации праймеров. При этом гомозиготная делеция будет диагностирована на основании полного отсутствия ПЦР-продукта реакции (синтез ДНК невозможен с обеих копий гена). При гетерозиготной делеции возможно выявление ПЦР-продукта, синтезированного с нормального (сохранного) аллеля, однако для достоверной диагностики такой мутации необходимо использование более сложных методов визуализации ДНК, позволяющих оценить дозу конечного ПЦР-продукта.

Для выявления точковых мутаций (чаще всего нуклеотидных замен) в определенных сайтах метод ПЦР используется в комбинации с другими методами молекулярно-генетического анализа. Если место локализации и характер предполагаемой точковой мутации точно известны, то для целенаправленного выявления такой мутации могут использоваться рестрикционные эндонуклеазы (рестриктазы ) – особые клеточные ферменты, выделяемые из различных штаммов бактерий.

Данные ферменты распознают специфические нуклеотидные последовательности длиной от четырех до десяти нуклеотидов. После чего осуществляют рестрикцию (лат. (разрезание) этих последовательностей в составе двунитевой молекулы ДНК. Каждая рестриктаза распознает и разрезает в фиксированном месте строго определенную, специфичную для себя нуклеотидную последовательность – сайт рестрикции (сайт узнавания).

В тех случаях, когда точковая мутация изменяет естественный сайт узнавания для определенной рестриктазы, данный фермент не сможет расщепить мутантный амплифицированный в ПЦР фрагмент. В некоторых случаях, мутация приводит к появлению нового сайта узнавания для той или иной рестриктазы, отсутствующего в норме.

В обеих ситуациях мутантный и нормальный ПЦР-продукты, обработанные выбранной рестриктазой, дадут различные по длине фрагменты рестрикции, что можно будет легко обнаружить при электрофорезе (рис. 15).

Таким образом, при необходимости быстрой детекции какой – либо конкретной точковой мутации задача сводится к поиску соответствующей рестриктазы, сайт узнавания которой локализован в месте нарушенной нуклеотидной последовательности. Обработка ПЦР-продуктов такой рестриктазой позволит легко дифференцировать нормальные и мутантные аллели. Рестрикционный анализ значительно упрощает обнаружение известных точковых мутаций и в настоящее время широко используется для прямой ДНК-диагностики наследственных заболеваний.

Заключительным этапом молекулярно-генетического анализа мутаций является определение нуклеотидной последовательности исследуемого фрагмента ДНК (секвенирование), которая сравнивается с нормой и формулируется окончательный генетический диагноз. Благодаря успехам молекулярной генетики в настоящее время разработаны методы ДНК-диагностики более 400 наследственных болезней.

Рис. 15. Выявление точковой мутации с помощью рестрикционного анализа: А – амплифицируемый участок гена, содержащий сайт рестрикции AGCT для рестрикционной эндонуклеазы Alu I . Мутация G → A изменяет данную нуклеотидную последовательность, в результате чего рестрикция ферментом AluI блокируется; Б – электрофореграмма продуктов рестрикции: дорожка 1 – гомозиготность по нормальному аллелю; дорожка 2 – гомозиготность по мутации; дорожка 3 – гетерозиготное состояние (нормальный аллель + мутация).

Диагностика наследственных болезней, основанная на прямом исследовании мутантных аллелей у больных, членов их семей или предполагаемых гетерозиготных носителей патологических мутаций, пригодна для досимптоматической и пренатальной диагностики, которая может быть применена на самых ранних стадиях развития плода, до появления каких-либо клинических или биохимических симптомов болезни.

Независимо от метода детекции мутаций точные молекулярные характеристики каждой мутации могут быть получены только путем прямого секвенирования. Для автоматизации этого процесса в последние годы широко используется специальные аппараты – секвенаторы, которые дают возможность значительно ускорить процесс считывания ДНК-информации.

Путь для более широкого применения молекулярно-биологических исследований в клинико-диагностических лабораториях открывают ускорение аналитического процесса за счет выполнения всех процедур в одном континууме, без переноса пробы, создание условий для предотвращения контаминации при параллельном исследовании ряда аналитов и при объективной регистрации результатов в каждом цикле.

Основные модификации метода ПЦР

Используются для быстрого сканирования и поиска известных генных мутаций.

Мультиплексная (мультипраймерная) ПЦР

Данный метод основан на одновременной амплификации в одной реакции нескольких экзонов исследуемого гена. Это позволяет проводить экономный экспресс-скрининг наиболее частых мутаций. К примеру, для быстрой диагностики носительства делеций в гене дистрофина у больных прогрессирующей мышечной дистрофией Дюшена/Беккера проводится одновременная амплификация набора наиболее часто мутирующих экзонов данного гена. Поскольку эти заболевания наследуются по Х-сцепленному рецессивному типу и связаны с повреждением у мальчиков единственной Х-хромросомы, в случае протяженной делеции при электрофорезе продуктов реакции будет выявлено отсутствие одного или нескольких фрагментов ДНК (экзонов), что может служить молекулярным подтверждением диагноза. Кроме этого, путем подбора для ПЦР-амплификации конкретных участков гена возможна достаточно точная оценка общей протяженности делеции и точек разрыва гена (в плоть до экзона).

Комбинированное использование нескольких мультиплексных реакций позволяет диагностировать до 98% всех делеций, имеющих место у больных прогрессрующей мышечной дистрофией Дюшенна/Беккера. Это составляет приблизительно 60% от общего числа известных мутаций в гене дистрофина и свидетельствует о весьма высокой эффективности данного скринингового метода ДНК-диагностики дистрофинопатий (рис. 16).

Рис. 16. Прямая ДНК-диагностика мышечной дистрофии Дюшенна с помощью мультиплексной ПЦР (электрофорез в агарозном геле). У каждого из обследуемых лиц одновременно амплифицированы четыре экзона гена дистрофина (экзоны 17, 19, 44 и 45; стрелки указывают на соответствующие продукты амплификации). Дорожка 1 – контроль, дорожки 2-5 – больные мышечной дистрофией Дюшенна с различными делециями гена дистрофина (дорожки 2 и 5 – делеция экзона 45, дорожка 3 – делеция экзона 44, дорожка 4 – делеция экзона 17 и 19).

Аллель-специфическая амплификация

Метод основан на использовании двух самостоятельных пар праймеров к конкретному участку гена: один праймер в обеих парах является общим, а второй праймер в каждой паре имеет различную структуру и является комплементарным либо нормальной, либо мутантной последовательности ДНК. В результате такой реакции в растворе одновременно могут синтезироваться две разновидности ПЦР-продуктов – нормальные и мутантные. Причем дизайн используемых праймеров дает возможность четко дифференцировать нормальные и мутантные продукты амплификации по их молекулярному размеру. Данный метод является очень наглядным и позволяет верифицировать как гомо-, так и гетерозиготное носительство мутантного аллеля.

Метод сайт-направленной модификации амплифицированной ДНК

Метод основан на использовании в ПЦР так называемого mismatch-праймера (не полностью комплементарного матрице), который отличается от матричной ДНК-последовательности на один нуклеотид. В результате включения указанного праймера в состав мутантного ПЦР-продукта в нем образуется искусственно созданный сайт рестрикции для одной из рестрикционных эндонуклеаз, что позволяет провести прямую ДНК-диагностику определенной известной мутации с помощью рестрикционного анализа. Создание такого искусственного сайта рестрикции бывает необходимо в том случае, если проведенный поиск не выявил существование известного и доступного фермента, «естественный» сайт рестрикции которого затрагивается в результате появления в молекуле ДНК исследуемой мутации.

Метод обратно-транскриптазной ПЦР (RT - PCR )

Данный метод используется в тех случаях, когда в качестве объекта исследования удобнее использовать не генномную ДНК, а более компактную и информационно «насыщенную» кДНК, получаемую после соответствующей обработки образцов тканей, например биопсийного материала или клеточных линий лимфоцитов, фибробластов и т. д. Важным условие здесь является экспрессия (хотя бы минимальная) нужного гена в исследуемой ткани.

На первом этапе проводится обратная транскрипция мРНК, и получаемые молекулы кДНК служат матрицей для ПЦР. В последующем амплифицированный в достаточном количестве критический участок кДНК подвергается секвенированию и другим методам мутационного скрининга, прямому электорофоретическому исследованию (выявление делеций, вставок и т. д.) либо встраиванию в экспрессионную систему с целью получения белкового продукта и его непосредственного анализа.

Данный метод особенно эффективен для детекции мутаций, ведущих к синтезу «усеченного» белка (нонсенс-мутации, мутации сплайсинга, крупные делеции) – так называемый РТТ-анализ (Protein Truncation Test). РТТ-анализ обычно используется при исследовании протяженных мультиэкзонных генов, таких как ген мышечной дистрофии Дюшенна/Беккера, атаксии-телеангиоэктазии или нейрофиброматоза 1 типа.

ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR, англ.)

С каждым годом в практическом здравоохранении ПЦР в реальном времени становится все более востребованным методом диагностики. Его принципиальной особенностью является мониторинг и количественный анализ накопления продуктов полимеразной цепной реакции и автоматическая регистрация, и интерпретация полученных результатов. Этот метод не требует стадии электрофореза, что позволяет снизить требования, предъявляемые к ПЦР лаборатории. Благодаря экономии производственных площадей, уменьшению количества персонала и востребованности количественного определения ДНК/РНК этот метод в последние годы успешно применяется в крупнейших санитарно-эпидемических, диагностических и научно-исследовательских центрах развитых стран мира, замещая ПЦР в ее сегодняшнем ("классическом") формате.

ПЦР в реальном времени использует флуоресцентно меченые олигонуклеотидные зонды для детекции ДНК в процессе ее амплификации. ПЦР в реальном времени позволяет провести полный анализ пробы в течение 20-60 мин и теоретически способен детектировать даже одну молекулу ДНК или РНК в пробе.

Рис. 17. ПЦР в реальном времени.

ПЦР в реальном времени использует TaqMan систему, контролирующую кинетику ПЦР непосредственно в ходе амплификации с использованием резонансного тушения флуоресценции. Для детекции используется зонд, несущий флуорофор и тушитель, комплементарный средней части амплифицируемого фрагмента. Когда флуорофор и тушитель связаны с олигонуклеотидным зондом, наблюдается лишь незначительная флуоресцентная эмиссия. Во время процесса амплификации за счет 5"-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы флуоресцентная метка переходит в раствор, освобождаясь от соседства с тушителем, и генерирует флуоресцентный сигнал, усиливающийся в реальном времени пропорционально накоплению амплификата (рис. 17).

Основные преимущества ПЦР-Real-Time перед ПЦР с гель электрофорезом :

· Весь метод проходит в одной пробирке;

· Проведение метода занимает 1 час;

· Достаточно 1-2 рабочих комнат;

· Наряду с качественной оценкой результата появляется возможность количественной оценки (например, при назначении противовирусной терапии при СПИДе или вирусных гепатитах необходимо знать вирусную нагрузку, т. е. количество вируса на 1ед., что обеспечивает ПЦР real time);

· Резко снижается риск контаминации.

Заключение

Метод ПЦР является одним из наиболее распространенных методов молекулярно-биологических исследований. Данный метод должен применяться клиницистами осмысленно, и врач, решивший использовать ПЦР в своей, работе должен обладать определенными знаниями об особенностях и возможностях данного метода. Во-вторых, между клиницистом и ПЦР-лабораторией должна существовать тесная обратная связь, необходимая для анализа сложных слу­чаев и выработки правильной диагностической стратегии. В-третьих, ПЦР-анализ не является пана­цеей в диагностике (прежде всего инфекционных заболеваний) и не заменяет существующие методы исследований, а лишь дополняет их. И главное - ПЦР не может заменить интуицию и аналитическое мышление, которыми должен обла­дать врач, рассчитывающий на успех.

P . S . Молекулярно-биологические исследования - смена ориентиров диагностики и лечения. С применением молекулярно-биологических методов связывают перспективу радикальной смены акцентов в лабораторной диагностике. Речь может идти не просто о своевременной информации, а об ее заблаговременном получении. Если сейчас лабораторные исследования в большинстве случаев проводятся уже при развившейся болезни и начатом лечении, то молекулярно-биологическая лабораторная информация, как ожидают, даст возможность выявить наклонность человека к некоторым видам патологии и степень чувствительности к некоторым лекарствам, что позволит обосновать предсказательный, профилактический и персонализированный характер медицины будущего.

СМЕНА ОРИЕНТИРОВ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ

НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ

Сегодня В будущем

Диагноз Генетический паспорт

8. Сколько рабочих комнат необходимо для работы ПЦР-лаборатории с флуоресцентной детекцией (количественный анализ, Real-Time PCR)?

9. Что такое детекция?

10. Какие методы ДНК-диагностики выделяют?

11. Работа какого фермента лежит в основе ПЦР?

12. Почему зону детекции необходимо удалять от других рабочих зон?

13. Что такое сайт рестрикции?

14. В чем отличия прямого метода ДНК-диагностики от косвенного?

15. Что такое секвенирование?

16. Что такое мультиплексная ПЦР?

17. Какие типы мутаций определяют при помощи ПЦР?

18. Что такое контаминация?

19. В чем заключается сущность метода аллель-специфической амплификации?

20. Условия хранения материала для ПЦР?

21. В каком приборе проходит амплификация?

22. В чем заключается метод обратно-транскриптазной ПЦР (RT-PCR)?

23. Что служит материалом для ПЦР-диагностики?

24. Перечислите виды контаминации?

Тесты для самоподготовки

1. Эндонуклеазные рестриктазы:

а) ферменты, «разрывающие» ДНК в строго специфических местах;

б) ферменты, сшивающие разрывы молекулы ДНК;

в) ферменты, обеспечивающие соединения, осуществляющие репарацию ДНК.

2. Амплификация генов:

3. Какой из методов молекулярной генетики применяется для диагностики болезней, обусловленных мутантным геном известной последовательности?

а) использование специфичной рестриктазы;

б) прямая детекция с использованием специфичных молекулярных зондов;

в) семейный анализ распределения нормального полиморфизма длины рестрикционных фрагментов.

4. Секвенирование ДНК:

а) идентификация последовательности оснований ДНК;

б) многократное повторение какого-либо участка ДНК;

в) выделение фрагмента ДНК, содержащего изучаемый ген.

5. Для получения образцов ДНК можно использовать :

б) ворсины хориона;

в) амниотическую жидкость;

г) клетки амниотической жидкости;

д) биоптаты кожи, мышц, печени,

е) все верно, кроме пункта «в»,

ж) все верно, кроме пункта «г»,

з) все вышеперечисленное верно.

6. Для диагностики каких мутаций применяется метод ПЦР:

а) геномные;

б) хромосомные;

в) генные (точечные).

7. Праймер это:

а) комплементарный участок ДНК;

б) синтетическая олигонуклеотидная меченая (радиоактивно или флюоресцентно) последовательность, комплементарная мутантному или нормальному гену;

в) олигонуклеотид, выполняющий роль «затравки» и инициирующий синтез полинуклеотидной цепи на ДНК- или РНК - матрице.

8. Кем был разработан принцип метода ПЦР?

б) К. Мюллис

9. Применяется ли метод ПЦР для диагностики экспансии тринуклеотидных повторов (динамического типа мутаций)?

10. В каких областях применяется ПЦР?

а) клиническая медицина;

б) определение трансгенных организмов (ГМО)

в) идентификация личности, установление отцовства, криминалистика

г) все вышеперечисленное,

д) ничего из вышеперечисленного..

Эталоны ответов: 1 – а; 2 – б; 3 – б; 4 – а; 5 – е; 6 – в; 7 – в; 8 – б; 9 – а, 10 – г.

Основная

1.Бочков генетика. Москва. ГЭОТАР, 2002.

Дополнительная

1. , Бахарев и лечение врожденных и наследственных заболеваний у детей. – Москва, 2004.

2. ДНК-диагностика и медико-генетическое консультирование. – Москва, 2004.

3. Гинтер генетика. – Москва, 2003.

4. Горбунов основы медицинской генетики. – СПб.: Интермедика, 1999.

5. Херрингтон С., Дж. Макги. Молекулярная клиническая диагностика. – Мир, 1999.

6. Меньшиков -биологические исследования в клинической лабораторной диагностике: возможности проблемы (лекции). Клиническая лабораторная диагностика, № 3, 2006.

7. Корниенко работы ПЦР-лаборатории при поточном анализе биологического материала. Клиническая лабораторная диагностика, № 10, 2006.

8. Организация работы ПЦР-лаборатории. Методические указания. МУ 1.3.1794-03. Главный санитарный врач РФ, 2003.

9. Erlich H. A. PCR technology. – Percin-Elmer Cetus, 1993.

10. Heid C. A., Stevens J. Real time quantitative PCR. Genome Res. – № 6, 1996.

ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ МЕТОДА

ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

Методическое пособие для внеаудиторной работы студентов 3-4 курсов по специальностям лечебное дело (060101) и педиатрия (060103).

ГОУ ВПО «Красноярская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Россия, Красноярск,

Полимеразная цепная реакция (сокращённо ПЦР) – современный и сверхточный метод диагностики на генетическом и молекулярном уровне. ПЦР-диагностика дает возможность определить у человека наличие инфекции или наследственной болезни.

Сущность метода состоит в том, что ДНК либо РНК взятого на исследование материала подвергается многократному преумножению (амплификации), что возможно при наличии ферментов. Благодаря этому получают большую массу ДНК либо РНК, по которой делают визуальную оценку. У специалистов имеется база сведений о строении всех болезнетворных возбудителей и в соответствии с ней дается оценка, какой микроорганизм получили.

Исследуемый материал (слюна, кровь, мокрота, др.) помещают внутрь специального прибора (амплификатор) и добавляют определенные ферменты. Они соединяются с исследуемыми ДНК либо РНК и вызывают синтез их копий. Посредством ПЦР возможно определить тип возбудителя, его количество.

Интересно! Метод ПЦР был изобретён в 1983 году американским учёным Кэрри Мюллисом. За это открытие ему была вручена Нобелевская премия по химии.

Пробирки с исследуемым материалом

Плюсы и минусы

Методика ПЦР стала применяться в сфере медицины с недавнего времени и заняла важное место в диагностическом процессе.

Преимущества метода:

1. Прямое определение возбудителя. Некоторые методы, к примеру, иммуноферментный анализ, даёт возможность выявить выделяемые микробами белки. Это косвенное определение присутствия возбудителей. А посредством ПЦР с высокой точностью выявляется кусочек ДНК, принадлежащий определённой инфекции.
2. Специфичность методики. Поскольку ПЦР выявляет ДНК, принадлежащему возбудителю, получить ложное заключение практически невозможно (за исключением неизвестного возбудителя). А при иммунологическом методе может произойти ошибка вследствие перекрёстной реакции между антигенами.
3. Большая чувствительность. Метод определяет присутствие даже очень малого количества бактерий либо вирусов в организме. Достаточно 10 болезнетворных клеток на одну пробу. Для других методов минимальное количество клеток должно быть не менее 105.
4. Универсальность методики. Процесс исследования в отношении разных микроорганизмов схож из-за подобия всех ДНК, РНК. На основании этого в одной пробе возможно выявить несколько возбудителей.
5. Быстрое получение заключения. От момента забора пробы до получения результата проходит не более 4-5 часов. При ПЦР не нужен посев культуры, поэтому метод довольно быстрый.
6. Эффективность диагностирования при скрытых видах инфекций. Метод выявляет те микроорганизмы, которые трудно или вовсе не поддаются культивированию. Такие возбудители встречаются при скрытых формах заболевания.
7. Широкая сфера использования. ПЦР может быть использована не только в целях диагностики болезней человека, но и для определения микроорганизмах в почве, продуктах, воде и пр.

Но можно столкнуться и с недостатками ПЦР-метода:

1. Микробы способны изменяться. Возбудители могут меняться и мутировать. Поэтому они могут не поддаваться определению посредством ПЦР.
2. Возможность умножения ДНК не только живого, но одновременно и мёртвого возбудителя. Чтобы избежать такой ситуации, использовать ПЦР можно только через 1-2 месяца после восстановления от перенесённой ранее болезни.

Разновидности ПЦР

Метод исследования применяется для различных целей, поэтому ПЦР-методика имеет разновидности:

1. С обратной транскрипцией – применяется для многократного удвоения и последующего определения того, РНК какого микроорганизма получилось выделить. Для этого используют библиотеку данных о структурах различных возбудителей.
2. Инвертированная – используется, когда имеется маленький участок внутри конкретной последовательности.
3. Вложенная – применяют для уменьшения количества нежелательных продуктов реакции. Для этих целей проводят два последовательных исследования.
4. Асимметричная – применяют в случае, если нужно умножить в большей степени одну из всех имеющихся цепочек ДНК.
5. Количественная (в реальном времени) – необходима для непосредственного изучения того, как меняется количество получаемого продукта в каждом новом цикле реакции ПЦР.
6. Цифровая – наиболее современная и точная.
7. Групп-специфическая – это такое исследование, которое проводится в целях изучения родственных связей.
8. Ступенчатая – снижает влияние неспецифического взаимодействия праймеров.

Наполнение пробирок образцами крови

Расшифровка результатов

В заключении исследования даётся однозначный ответ о наличии возбудителя, который бывает:

• отрицательным, это означает, что инфекции нет;
• положительным – она есть.

Выявление инфекции может произойти и при отсутствии симптомов болезни у человека. Это начальная стадия заражения. Иногда можно получить ложноположительный ответ (на грани отрицательного и положительного результата). В этом случае анализ необходимо сделать повторно. Особое внимание нужно уделить тому, чтобы материал был собран при полном соблюдении всех требований.

Сроки готовности ПЦР-анализа

На практике результат исследования можно получить через 2 дня. Иногда его могут сделать быстрее – в день сдачи.

Цена на проведение процедуры

Стоимость ПЦР определяется тем, какую инфекцию будут исследовать. Также она зависит от методики проводимого тестирования. Средняя цена анализа находится в пределах от 200 до 850 руб. В стоимость входит и плата за забор материала — около 400 руб.

Ориентировочные цены на исследование ПЦР.

Зачастую медицинские учреждения предлагают провести анализ одновременно на несколько инфекций, чтобы выявить нужную. Такое обследование будет стоить дороже, но оно избавит от необходимости дополнительных исследований, что сэкономит время пациента.

Видео «Полимеразная цепная реакция»

В ролике рассказывается о сущности метода ПЦР и его преимуществах. Снято каналом SiberianMedicalLaboratory.

Анализ ПЦР — что это? Это эффективный метод молекулярной биологии, который применяют в комплексе с уже традиционными иммунологическими, морфологическими и биохимическими исследованиями. Инфекционные заболевания эволюционируют и развиваются, как и само человечество. С каждым годом их становится все больше, а диагностировать их все труднее. Факторы, которые провоцируют появление болезней и влияют на их развитие, тоже постепенно приспосабливаются к окружающим внешним условиям, меняясь вместе с ними. Это послужило причиной тому, что в медицине стали появляться новые методы и технологии, которые помогают получить более точные результаты в диагностике того или иного заболевания.

Такая методика лабораторной диагностики инфекционных заболеваний основывается на том, чтобы обнаружить возбудитель инфекции, которую подозревает врач в материале исследования. Полимеразная цепная реакция будет их идентифицировать, выявляя соответствующий генетический материал (РНК либо ДНК) в пробах, которые взяты у пациента.

ПЦР была изобретена американским ученым Кэри Мюллисом в 1983 году.

Большинство инфекций, если выявить их на ранних стадиях развития, хорошо поддается лечению. Именно поэтому метод ПЦР столь действенный, ведь он способен выявить даже вирусы или бактерии, чьи клетки единичны в материале. Более того, такая диагностика определяет вирус, устанавливает природу его появления, силу, с которой он воздействует на организм, даже количество микробов в организме пациента. Всю информацию, полученную методом полимеразной цепной реакции, врач сможет применить для того, чтобы выбрать подходящие лекарственные препараты и назначить соответствующее лечение.

Исследование методом ПЦР

По самому принципу работы все происходит достаточно просто. Взятый у пациента биологический материал помещают в специальный реактор. Потом туда же добавляются такие специфические ферменты, которые смогут связаться с ДНК существующего в материале микроба и совершить синтез ее копии.

В основе копирования лежит принцип цепной реакции. То есть на совершение всего процесса потребуется несколько этапов. Сначала 1 молекула ДНК образует 2 новые молекулы, потом из них получится уже 4 новых, и так до сотен и тысяч копий. После этого будет проведен анализ и его расшифровка.

Фрагменты ДНК микроба могут содержаться в различном биологическом материале:

• в биологических жидкостях (слюне, суставной, околоплодной, плевральной, спинномозговой жидкости, соке простаты);
• в крови и ее сыворотке, в плазме;
• в соскобе эпителиальных клеток (соскоб из цервикального канала, из уретры — как для женщин, так и для мужчин);
• в моче (на анализ потребуется утренняя моча, а именно ее первая порция);
• в мокроте;
• в слизи и других биологических выделениях;
• в биопатах желудка и двенадцатиперстной кишки.

Какие заболевания могут быть выявлены методом ПЦР?

Врачи считают этот вид диагностики одним из наиболее точных. Данное исследование позволяет обнаружить практически все вирусные заболевания, которые на сегодняшний день известны медицине. Очень важным аспектом является и то, что среди них есть такие инфекции, которые живут в человеческом организме долгие годы, при этом никак не проявляя себя. Они просто растут в ожидании, когда им будет наиболее комфортно проявиться (снижение иммунитета, истощение организма и прочее). Выявление таких инфекций скрытого типа особенно актуально в урологических и гинекологических областях.

Вот некоторые заболевания, по которым зачастую проводят анализ методом полимеразной цепной реакции:

• гепатиты В и С;
• многие болезни, которые передаются половым путем (диагностика хламидиоза, уреаплазмоза, микоплазмоза, кандидоза половых органов, бактериального вагиноза, трихомониаза, инфекционного мононуклеоза, папилломавирусной инфекции (ВПЧ), СПИДа и пр.);
• герпесная инфекция (включая и половой герпес);
• туберкулез и хеликобактериоз.

Метод ПЦР дает хорошие результаты, потому что большинство из этих заболеваний характерно тем, что их симптомы (особенно на ранней стадии) не особо приметны. Зато последствия, которые они оказывают на организм, очень негативны и зачастую весьма опасны для здоровья и даже жизни.

К примеру, болезни, передающиеся половым путем, могут у женщин существенно увеличить возможность возникновения рака шейки матки, негативно повлиять на течение беременности или стать причиной бесплодия. К тому же именно от здоровья матери зависит и здоровье ее будущего малыша. Поэтому очень важно при малейших подозрениях на скрытые инфекции вовремя сдать кровь на диагностику, чтобы не допустить заражения плода через проникновение возбудителей болезни. Для мужчин последствия не менее негативные: снижение подвижности и жизнеспособности сперматозоидов, развитие мужского бесплодия и простатита, поражение мочеиспускательного канала и прочее.

Такой анализ очень актуален и для своевременного выявления вирусного гепатита, туберкулеза, различных кишечных инфекций. Когда требуется немедленное лечение, очень важно понимать, какой именно возбудитель поразил организм и с чем предстоит бороться. Кровь или любой другой биологический материал пациента поможет провести полную и правильную диагностику и назначить лечение, которое поможет скорейшему восстановлению функций организма и будет способствовать выздоровлению.

Герпес тоже чрезвычайно устойчив и опасен. Из неактивного режима он легко может перейти в прогрессирующий, поражая центральную нервную систему, влияя на возникновение и развитие таких страшных болезней, как менингит и энцефалит.

Расшифровка анализа

После проведения исследования вы можете получить либо положительный, либо отрицательный результат. Именно положительные результаты будут указывать на то, что та или иная инфекция присутствует в вашем организме. Отрицательный результат расшифровывается так, что в организме пациента предполагаемая инфекция отсутствует. То есть в биологическом материале, который был сдан на исследование, ничего не обнаружили.

Любые показатели должен расшифровать и озвучить вам врач. Не расстраивайтесь и не пугайтесь плохих результатов, ведь реакция выявила заболевание, а это значит, что после дополнительных обследований доктор сможет назначить полноценное лечение. Главное — не заниматься самолечением и не затягивать процесс.

Подготовка к анализу: что нужно знать?

Для обнаружения разных заболеваний потребуются разные биологические материалы. До того как сделать ПЦР, обязательно проконсультируйтесь с соответствующим специалистом и тщательно подготовьтесь к предстоящей процедуре.

Для этого понадобится строго выполнять все рекомендации и указания вашего доктора. Не забудьте, что кровь, как правило, берут натощак. Для сдачи мазка из влагалища или уретры нужно 1-2 суток воздержаться от половых контактов, всю необходимую гигиену половых органов проводить с вечера, а утром только ополоснуть теплой водой. Также важно прекратить приблизительно за неделю прием лекарственных препаратов, если они не оговорены с врачом. И в течение 2-3 часов до того, как сдать анализ, не мочиться. Для женщин стоит учесть то, что оптимальное время для проведения исследования — это несколько дней перед или сразу после менструации.

Метод ПЦР: основные достоинства и недостатки

У данного вида диагностики очень много преимуществ.

Во-первых, любые возбудители инфекционных заболеваний определяются по прямому на них указанию, в отличие от других традиционных лабораторных исследований.

Во-вторых, этот анализ просто универсальный, ведь для его проведения доступны почти любые биологические материалы, которые зачастую не приемлет любой другой метод исследования.

Очень важным является тот момент, что когда проводится эта диагностика, то в исследуемом материале происходит выделение фрагмента ДНК, который будет присущ только какому-то конкретному возбудителю, то есть сугубо определенному вирусу или бактерии. Это говорит о том, насколько специфичной является данная реакция.

Еще одним аргументом в пользу этой диагностики будет высокая скорость ее выполнения. Если для любых культуральных исследований потребуются не дни, а даже недели, необходимые для выделения и выращивания возбудителя на культуре клеток, то данный метод позволит получить результаты в течение 4-5 часов.

ПЦР дает возможность обнаружить не только ту инфекцию, которая уже находится на пике заболевания, но также и хронические болезни, любые единичные вирусы или бактерии. Такая диагностика возможна из-за очень высокой чувствительности метода. Сюда следует отнести и тот факт, что инфекция будет обнаружена даже в том случае, если в биологическом материале, который был сдан на анализ, будет присутствовать всего лишь одна клетка того или иного вируса либо бактерии.

Реакция на ложноотрицательные результаты встречается очень редко.

Правда, метод имеет и свои недостатки. Одним из них является возможность получения ложноположительного результата. Это зачастую происходит из-за того, что инфекция уже убита, но ее клетки эпителия еще не обновились, поэтому ее мертвые остатки реакция все равно увидит и будет клонировать. Поэтому стоит либо дождаться полного выведения из организма мертвых клеток инфекции (от месяца до двух после проведенного лечения), либо на раннем сроке использовать другие методы: посев или культуральный. Позже можно будет провести контроль и с помощью ПЦР.

Еще одной слабостью анализа считается изменчивость всех микроорганизмов. Это значит, что какие-то генотипы возбудителей, которые уже мутировались в организме, будут неуловимы для тест-системы и никакая реакция не произойдет. Для этого производятся различные разработки, чтобы усовершенствовать данный метод.